تشخیص آزمایشگاهی سیفلیس

  ترپونما (Treponema)

از نقطه‌نظر پزشكي مهم‌ترين اسپيروكت‌ها ترپونما‌ها هستند. بيشتر ترپونما‌ها غيربيماريزايند و قسمتي از فلورنرمال مخاط دهان هستند. ولي بعضي‌ها نيز در انسان بيماري‌زا مي‌باشند. شناخته‌شده‌ترين ترپونما‌ي بيماري‌زا ترپونما پاليدوم است كه سه زيرگونه دارد:

(1) ترپونما پاليدوم زيرگونه پاليدوم (Treponema pallidum subspecies pallidum) (سابقاً ترپونما پاليدوم ناميده مي‌‌شد) عامل سیفليس؛

(2) ترپونما پاليدوم زيرگونه اندوميكوم (سابقاً ترپونما پاليدوم II ناميده مي ‌شد) عامل بژل يا سیفليس اندميك؛

(3) ترپونما پاليدوم زيرگونه پرتنوئه (سابقاً ترپونما پرتنوئه ناميده می‌شد) عامل ياز. ترپونماي پاتوژن ديگر، ترپونما كاراتئوم است كه عامل پينتا است.

ترپونما پاليدوم

ترپونما پاليدوم زيرگونه پاليدوم عامل سیفليس است. بيماري در اروپا در قرن‌هاي پيش به نام « آبله بزرگ» (براي افتراق از آبله) ناميده شد و به نظر می‌رسد كه باكتري در آن روزگاران بسيار بيماري‌زاتر از امروز بوده و بيماران معمولاً دچار زخم‌هاي اولسراتيو بزرگ (آبله بزرگ) و گرانولوماهاي بدشكل در بافت‌هاي غضروفي (گوما) مي‌‌شده‌اند. هنگامي كه شكسپير گفت: "آبله بر تو باد" منظور او آبله گاوي نبود، بلكه سیفليس بود. میزان بروز سيفلیس اولیه و ثانویه در ایالات متحده آمریکا از سال ۱۹۹۰ تا ۲۰۰۰ میلادی به میزان ۲/۸۹ درصد کاهش یافته است. اگر چه میزان عفونت از ۵۹۷۹ مورد در سال ۲۰۰۰ به ۶۱۰۳ در سال ۲۰۰۱ افزایش یافته است. مرکز کنترل و پیشگیری بیماری در نوامبر ۲۰۰۲ اعلام کرد این اولین افزایش از سال ۱۹۹۰ به بعد می‌باشد. نگرانی روز افزون در این مورد است که سيفلیس احتمال انتقال ( ایدز ) را 35 برابر افزایش می‌دهد. سیفليس از طريق جنسي به بالغين و مادرزادي به جنين و نوزاد منتقل مي‌‌گردد. به‌ازاي هر بار تماس جنسي با فرد آلوده امكان انتقال بيماري 1 به 10 است. ميانگین دوز آلوده‌كننده ID50 براي ترپونما پاليدوم حدود 57 باكتري است. در بالغين عفوني، بيماري داراي مراحل اول، دوم و نهفته و سوم مي‌باشد. خطر انتقال سیفليس از طريق جفت از مادر به جنين بسته به مرحلة عفونت در طي دوران حاملگي مادر دارد. عفونت اوليه احتمال 100 درصد، ثانويه 90 درصد، ابتداي نهفتگي 30 درصد و انتهاي نهفتگي و مرحلة سوم 5 درصد انتقال مادر به جنين دارد.

با كمال تعجب، با توجه به شاخص‌هاي كلينيكي سیفليس، درباره باكتري يا پاتوژنيسيته آن اطلاعات زيادي در دسترس نيست. اين امر بيشتر به اين دليل است كه تاكنون نتوانسته‌اند ترپونما پاليدوم را در شرايط آزمايشگاهي كشت بدهند. تا امروز فقط توانسته‌اند باكتري‌ را از خرگوش به محيط كشت سلول‌ها‌ي اپي‌تليال خرگوش انتقال بدهند كه ترپونما براي چند نسل محدود در آن تكثير مي‌‌كند. معمولاً ترپونما پاليدوم با تلقيح به بيضه خرگوش كشت داده مي‌‌شود. زمان دو برابر شدن در اين محل 30 ساعت است و به‌كندي تكثير مي‌‌يابد.Field Steel و همكاران يك محيط كشت فيبروبلاست به صورت يك لايه جهت كشت ترپونما تهيه نمودند. ترپونما پاليدوم با انتهای تیز به سلول میزبان متصل شده و ساختار میکروتوبولی دارد. میکروائروفیل بوده، در خون و فراوردهای خونی در 4 درجه سلسيوس به مدت 24 ساعت زنده می‌ماند. به خشکی و دمای بیش از 42 درجه سلسيوس حساس است.

تشخيص آزمايشگاهي سیفلیس :

ترپونما‌ي بيماري‌زا به صورت روتين قابل كشت نيست، اما در اگزوداي زخم‌ها يا خون قابل‌نمايش است.برداشت نمونه در مراحل سيفليس اوليه (شانكر سخت) از سروزيته زخم و از ترشحات چركي در جوش‌هاي سيفليسي صورت مي‌گيرد.براي تشخيص از روش‌هاي زير استفاده مي‌گردد.

•1- آزمايش مستقيم:

به دو صورت مي‌توان باكتري را مشاهده نمود.

الف - قسمتي از ترشحات را بين لام و لامل قرار داده و سپس بوسيله وازلين يا پارافين اطراف لامل را پوشانده تا از رسيدن هوا به باكتري و مرگ آنها جلوگيري شود، سپس مشخصات شكلي و حركت باكتري را در زير ميكروسكوپ زمينه تاريك مشاهده مي‌نمايند.

نکته مهم: ترپونما کانیکولی که در خرگوش‌ها بیماری‌زا می‌باشد از نظر مورفولوژی مشابه ترپونما پالیدوم بوده و با آن اشتباه می‌گردد.

ب- از ترشحات چركي گسترش تهيه نموده و پس از فيكس نمودن با رنگ‌آميزي فونتاناتري بوندو ، وارتين استاري (جهت رنگ‌آميزي بافت‌ها) و فلورسانت رنگ مي‌نمايند ( شكل1). در اينجا تركيبات نقره سبب ضخيم شدن جسم باكتري و قابل مشاهده شدن توسط ميكروسكوپ نوري مي‌شود كه باكتري به رنگ قهوه‌اي و زمينه لام، گندمي شكل خواهد بود.

2- روش‌هاي سرولوژيكي

در مراحلي كه عامل عفونت را نتوان مورد شناسايي قرار داد، از تست‌هاي سرولوژيك استفاده مي‌شود. دو دسته تست ترپونما‌يي و غيرترپونمايي براي تشخيص سیفليس استفاده مي‌شوند.

•1-2- تست‌هاي غيرترپونما‌يي

تست‌هاي غيرترپونما‌يي آنتي‌بادي‌هاي رآژين را اندازه مي‌گيرد كه آنتي بادي‌هايي هستند كه آنتي‌ژن حاوي كارديوليپين-ليستين را شناسايي مي‌كند. مبتلايان به سيفليس مقادير فراواني آنتي‌بادي‌هاي آنتي‌فسفوليپيد (APA) توليد مي‌كنند كه با روش‌هاي مختلفي قابل جستجو است. همچنين اين آنتي‌بادي‌هاي APA در كساني كه با بعضي داروها درمان مي‌شوند يا مبتلا به بعضي بيماري‌ها هستند، ديده مي‌شوند و به نظر می‌رسد وجود آن‌ها در زنان سبب سقط شود.آنتی‌بادی‌های APA كه در اثر بيماري‌هاي ترپونمايي نيستند را لوپوس آنتي‌كوآگولانتمي‌نا‌مند. بعضي از سيستم‌هاي آزمايش غيرترپونما‌يي كه براي تشخيص سيفليس استفاده مي‌شود عبارت است از تست VDRL (Veneral disease research laboratory)؛ تست كولمر واسرمن (فيكساسيون كمپلمان)؛ ART (The Automated Reagin Test)، RPR ‌ (Rapid Plasma Reagin)، USR(Unheated Serum Reagin) و TRUSR(Toloiden Red Unheated Serum Reagin).ازآنجايي‌كه آنتي‌ژن‌هاي تست‌ها و غلظت‌هايشان در تست‌ها فرق مي‌كند، از نظر ميزان نتايج آنها قابل‌مقايسه نيستند. در مبتلايان به سيفليس اوليه، نتيجه با VDRL 1 تا 3 هفته بعد از ظهور شانكر مثبت مي‌شود. تمام بيماران مبتلا به مرحلة دوم VDRL‌مثبت دارند و در مرحله نهفتگي VDRL رو به افول مي‌نهد. گاهي در مرحلة سوم VDRL‌منفي است.

تست VDRL‌ و ساير تست‌هاي غيرترپونما‌يي براي غربالگري مبتلايان به سيفليس استفاده مي‌شود، زيرا آسان، ارزان و قابل‌اعتمادند. ابتدا بر روي فرد مشكوك اين آزمايشات انجام مي‌شود، اگر جواب آن مثبت باشد، سپس با آزمايش‌هاي گران‌تر، اما بسيار اختصاصي‌تر يعني تست‌هاي ترپونما‌يي، تشخيص سيفليس انجام مي‌شود.

معایب این تست‌ها:

واکنش بیولوژیک مثبت کاذب (حاد و مزمن)؛ از موارد حاد (پایداری کمتر) می‌توان به سرخک و از موارد مزمن (بیش از 6 ماه پایدار) به اعتیاد اشاره کرد که تست را مثبت می‌کنند. بیماری‌های مالاریا، جذام، منونوکلئوز عفونی، واکسیناسیون(به‌خصوص واکسن سرخک)، بیماری‌های عروقی کلاژنی (لوپوس، پلی‌آرتریت نودوزا و ناهنجاری‌های روماتوئیدی) سبب مثبت کاذب شدن تست‌های فوق می‌گردند.

•2-2- تست‌هاي ترپونما‌يي

تست‌هاي ترپونما‌يي آنتی‌بادی‌های ضد آنتی‌ژن‌هاي واقعي و اصلي ترپونما را اندازه‌گيري مي‌كنند. يك بار هر نمونه سرم با ترپونما پاليدوم زنده بر روي يك اسلايد انكوبه مي‌شود و بررسي مي‌شود كه اگر حاوي آنتی‌بادی باشد سبب توقف حركت باكتري‌ مي‌شود، انجام اين تست بي‌حركتي ترپونما پاليدوم (TPI= T. pallidum immobilization) يا تست نلسون و بدست آوردن نتيجه درست، مشكل است و در بيشتر آزمايشگاه‌ها به‌جاي آن از تست فلورسنت ترپونمايي آنتی‌بادی FTA)) استفاده مي‌شود. تست FTA را مي‌توان اختصاصي‌تر كرد بدين ترتيب كه اول سرم بيمار را با ترپونماي كومنسالي به نام ترپونما‌ي رايترز مجاور كرده تا آنتی‌بادی‌هايي كه كمتر اختصاصي هستند با آنتی‌ژن‌هـــــاي گروه ترپونما واكنش د‌هند و حذف شوند FTA) ابزوربشن يا FTA-ABS نام دارد). حضور عفونت ترپونمايي توسط تست هماگلوتيناسيون ترپونمايي (TPHA) نيز قابل ارزيابي است.

آنتی‌بادی ضدترپونمايي كه در تست FTA اندازه‌گيري مي‌شود زودتر از آنتی‌بادی‌هاي رآژنيك در مرحلة اول سیفليس ظاهر مي‌شوند. همچنين VDRL بعضي بيماران در انتهاي سيفليس اوليه منفي مي‌شود. در حالي‌كه همان موقع FTA بسياري از بيماران مثبت است. ارتباط بين مرحلة بيماري و تظاهر آنتی‌بادی‌های FTA و VDRL در جدول 1نشان داده شده است. تست FTA خيلي زودتر از تست VDRL مثبت مي‌شود، اختصاصي‌تر است و در بيشتر بيماران تا سيفليس مرحلة سوم مثبت باقي مي‌ماند. بالاخره عفونت‌هاي مادرزادي قابل تشخيص بايد با استفاده از تست آنتي‌ IgM كونژوگه با فلورسنت (IgM FTA-ABS) صورت بگيرد.

بايد توجه كرد كه مبتلايان به ياز، بژل و پينتا نيز همين نتايج سيفليس‌ را در تست‌هاي ترپونما‌يي و غيرترپونما‌يي نشان می‌دهند و اين سه بيماري تنها براساس نتيجه تست‌هاي سرولوژيك از سيفليس قابل افتراق نيستند. در ضمن بايد به خاطر داشت از آنجا كه تست سرولوژيك در بيشتر موارد سيفليس براي تمام عمر مثبت است، پس وجود تنها يك آزمايش VDRL مثبت يا FTA مثبت دليل ابتلا به سيفليس فعال نيست.

3-تلقيح به حيوان:

بدليل اينكه تاكنون نتوانسته‌اند در آزمايشگاه با استفاده از محيط‌هاي كشت مصنوعي اين باكتري را كشت دهند براي تكثير اين باكتري از تلقيح به حيوان آزمايشگاهي مانند بيضه خرگوش، هامستر و خوكچه هندي استفاده مي‌نمايند. روش تشخيصي استاندارد طلائي تلقيح و آلوده‌سازي خرگوش با ترپونما مي‌باشد، زيرا اين روش راهي مستقيم جهت بررسي آلودگي مي باشد. تزريق داخل بيضه يا داخل جلدي به حيوان باعث ايجاد ضايعات بافتي در حيوان شده و اين ضايعات تا پايان عمر آلوده كننده باقي مي‌مانند و مي‌تواند به حيوانات ديگر منتقل گردد. اين روش گران و زمان‌بر مي‌باشد، لذا تنها در آزمايشگاه‌هاي تحقيقاتي و تنها براي بررسي حساسيت روش‌هاي مولكولي مانند PCR استفاده مي‌گردد.

4- روش‌هاي تشخيصي پيشرفته

امروزه در آزمايشگاه‌هاي پيشرفته از روش هاي تشخيصي مولكولي و غيرمولكولي پيشرفته مانند وسترن بلات، PCR و RT-PCR جهت تشخيص و تأئيد ساير تست‌ها استفاده مي‌كنند.

نتايج آزمايشگاهي در مراحل مختلف بيماري: تشخيص سيفليس براساس مجموع نتايج كلينيكي و نتايج آزمايشگاهي كه در بالا توضيح داده شد، صورت مي‌گيرد.

(الف) سيفليس اوليه.آنتی‌بادی ضد آنتی‌ژن ترپونمايي و غيرترپونمايي اغلب بعد از ظهور شانكر ظاهر مي‌شود. پس يك نتيجه تست سرولوژي منفي سيفليس اوليه را رد نمي‌كند. اگر جواب تست‌هاي سرولوژيك مثبت باشد و مخصوصاً اگر تيتر آنتی‌بادیبالارونده باشد امكان ابتلا خيلي زياد است. ترپونما به‌وفور در نمونه ترشحات مبتلايان در زير ميكروسكوپ دارك‌فيلد ديده مي‌شود. اگر شانكر در مخاط دهان باشد، اسپيروكت‌هاي فلور نرمال مي‌توانند در ميكروسكوپ دارك‌فيلد تداخل كنند و از ترپونما پاليدوم هم قابل‌افتراق نيستند. پس به‌همين دليل، لازم است كه منتظر نتايج مثبت سرولوژي باشيم تا از تشخيص مطمئن گرديم.

(ب) سيفليس مرحلة دوم. در بيماراني كه علائم كلينيكي واضح دارند، از ميكروسكوپ دارك‌فيلد براي شناسايي ترپونما در ترشح زخم‌هاي ثانويه استفاده مي‌شود. پاسخ مثبت سرولوژيك تشخيص را تأييد مي‌كند، زيرا تمام بيماران سيفليس مرحلة دوم نيز تست‌هاي ترپونما‌يي و غيرترپونما‌يي مثبت دارند.

(ج) سيفليس نهفته.بيماران مبتلا به سيفليس نهفته به‌صورت روتين تشخيص داده نمي‌شوند، زيرا زخمي ندارند و تنها وقتي كه تست روتين سرولوژيكي بدهند يا فرزند مبتلا به سيفليس به‌دنيا بياورند، مشخص مي‌شوند. در بيماراني كه تست غيرترپونما‌يي مثبت دارند، تشخيص با نشان دادن حضور آنتی بادی اختصاصي ضد ترپونما پاليدوم تأييد مي‌شود.

(د) سيفليس مرحلة سوم. اين نوع سیفليس، در بيماراني كه علائم سيفليس كارديوواسكولار، زخم گوما يا سيفليس عصبي دارند و در كساني كه تست ترپونما‌يي و غيرترپونما‌يي مثبت دارند، تشخيص داده مي‌شود. متأسفانه بيماران مبتلا به سيفليس عصبي تست سرولوژي منفي دارند كه تشخيص را مشكل‌تر مي‌سازد.

(ه) سيفليس مادرزادي.تشخيص در نوزادان داراي علائمي چون snuffles، زخم‌هاي اوليه يا لارنژيت با شناسايي ترپونما در زخم‌هاي غيردهاني و تأييد حضور آنتی‌بادی IgM مستقيم عليه ترپونما پاليدوم صورت مي‌گيرد. تست IgM- FTA-ABS براي اين منظور انجام مي‌شود. به‌خاطر داشته باشيد كه تست‌هاي معمول سرولوژيك IgG را تشخيص می‌دهند (بجايIgM) و هر نوع آنتی‌بادی IgG‌ در نوزاد ممكن است از طريق جفت، از مادر به جنين منتقل شده باشد.

(و) سيفليس در مبتلايان به ايدز. پاسخ تست‌هاي سرولوژيك ترپونما پاليدوم در اين بيماران كه به سيفليس مبتلا مي‌شوند طبيعي است و ظهور آنتی‌بادی‌های ترپونما‌يي و غيرترپونما‌يي و پيك تيتر آن در زمان معمول، ديده مي‌شوند. به‌دليل خطر سيفليس عصبي زودهنگام در مبتلايان به ايدز، بايد با ظهور علائم سيفليس از نظر بروز بيماري‌هاي عصبي با آزمايش مداوم مايع مغزي نخاعي تحت مراقبت باشد.

ترپونما ونسانتي

به همراه فوزوباكتريوم سبب عفونت دهاني آنژين ونسان مي‌شود. برداشت نمونه توسط سواپ از گلو انجام مي‌گيرد و پس از رنگ‌آميزي گرم باكتري‌هاي فنري شكل به همراه باكتري‌هاي دوكي شكل و سلول‌هاي چركي قابل‌مشاهده خواهند بود.

منبع:دكتر رضا ميرنژاد- باكتريولوژيست، استاديار دانشگاه

آزمایشگاه پارسه

مجله اینترنتی آزمایشگاه آمثبت