مروری بر روش وسترن بلات

1394/11/09

مروری بر روش وسترن بلات

 

آموزش روش وسترن بلات

 

همان طوركه مي دانيم در تكنیک ELISA پروئين ها در سطح حفرات پليت پوشش داده مي شوند و در انتهاي آزمايش ELISA،از يك واكنش رنگ زا براي شناسايي انجام واكنش يا عدم انجام آن استفاده مي شود.

اما در وسترن بلات ابتدا پروتئين توسط الكتروفورز روي ژل اكريل اميد جدا شده، سپس توسط جريان الكتريكي به غشاء نيترو سلولوز انتقال داده مي شوند. اين غشا شبيه به كاغذ معمولي است، اندازه حفرات آن كاملا مشخص است و توانايي زيادي در اتصال به پروتئين دارد پس از اينكه پروتئين به غشاء نيتروسلولوز انتقال داده شد بقيه مراحل شبيه به ELISA طي مي شود با اين تفاوت كه مسير حركت هر نمونه به شكل يك نوار بريده مي شود و درون ظزف خاصي كه شيار هايي به اندازه نوار بريده شده، قرار مي گيرد و بقيه مراحل در اين ظرف انجام ميگيرد .

به اين ترتيب به طور مثال اگر نمونه كشت ويروس HIV در اختيار داشته باشيم، بايد ابتدا انرا الكتروفورز نماييم. پس از الكتروفورز باندهاي پروتئيني را به gp۴۱ و gp۱۲۰ هر يك بنا به اندازه مولكول آن ها ، روي ژل تفكيك مي شوند .اكنون باندهاي پروتئين را به غشاي نيترو سلولز انتقال داده تا مراحل بعدي به راحتي صورت گيرد .

پس از اينكه پروتئين ها به غشاي نيترو سلولوز منتقل شدند، مرحله بعدي ميتواند به دو گونه طراحي شود :


الف) بعضي از مواقع هدف شناسايي پروتئين خاص در پروتئين هاي الكتروفورز شده است. اين حالت بيشتر در تحقيقات كاربرد دارد .


ب) در برخي موارد نيز مخلوط پروتيني ماهيت مشخصي دارد و حتي وزن مولكولي پروتئين هاي اين مخلوط و موقعيت آن ها پس از الكترو فورز مشخص مي باشند. در اين موارد مي توان حضور آنتي بادي عليه پروتئين هاي را در سرم مورد آزمايش بررسي نمود. در اكثر موارد تشخيص از اين روش استفاده مي شود.

به طور مثال پروتئين هاي ويروس HIV الكتروفورز شده، سپس به غشاي نيتروسلولوز منتقل مي شود. اكنون پس از مجاورت با سرم انساني هدف آزمايش بررسي وجود آنتي بادي عليه پروتئين غشايي يا مركزي HIV است. در اين مواقع علاوه بر حضور يا عدم حضور آنتي بادي اختصاصي مي توانيم مشخص سازيم كه آنتي فرد عليه چه جزئي از عامل بيماري زا است .
به اين ترتيب موارد مثبت كاذب مشاهده شده در آزمون ELISA در اينجا حذف مي شود و به طور اختصاصي واكنش دهي آنتي بادي ،مورد آزمون قرار مي گيرد.

در بسياري مواقع كه چندين بار (۲ تا ۳ بار) تست ELISAيك عامل عفوني خطرناك براي يك بيمار مثبت مي گردد، جهت تاييد تست الايزا از تست وسترن بلات استفاده مي شود نظير عفونت هاي HIV، HTLVو HSV .


البته امروزه براي بسياري از عفونت هاي ويروسي و باكتريايي تست تاييد وسترن بلات موجود است. به لحاظ تكنيكي در مواردي كه هدف ارزيابي حضور آنتي بادي خاص در يك سرم باشد، مراحل ذيل دنبال مي شود تا اينكه در انتها از طريق واكنش رنگ زايي رسوبي، اتصال آنتي بادي به آنتي ژن مشخص گردد. از انجا كه جايگاه حركت و قرار گيري آنتي ژن روي نوار نيترو سلولز مشخص است، مي توانيم مشاهده واكنش رنگي را دليل بر اتصال آنتي بادي اختصاصي به آن آنتي ژن بدانيم.

مجله اینترنتی آزمایشگاه آمثبت

 

   منبع خبر: گردآوری آمثبت

ارسال نظر

نام (اختیاری) :
*
ایمیل(اجباری):
نظر شما:
کد بالا :

نظرات کاربران